1. GC含量须在40%到80%之间，以确保sgRNA与目标DNA之间的稳定结合。

2. 确保sgRNA设计中的二级结构较少，如发夹结构和聚合酶终止序列。这些结构会影响克隆效率和向导的转录。

3. 去除polyA位点，如果以病毒作为递送工具，这些位点会破坏病毒包装。

4. 尽量减少错配，特别是PAM上游的前10个碱基。间隔区序列的后半部分可容忍错配，但靠近PAM位点的错配会破坏结合和随后的编辑。

5. sgRNA中的间隔区序列长度须与正在使用的Cas蛋白相匹配。两者之间的不一致会严重减低编辑效率。

6. 研究并选择最适合你需求的Cas蛋白。Cas蛋白在识别的PAM序列、切割类型及其他多个因素上存在差异，可能影响编辑性能。

7. 确保sgRNA启动子的位置不与其他启动子重叠，比如经常用于抗性基因转录的EF-1a启动子。与该启动子重叠会导致sgRNA的转录效率降低。

以下是一些常用的在线设计sgRNA的网站以及它们的特点：

1.CRISPR Design Tools（https://www.benchling.com/crispr/）：Benchling是基于目标序列的算法来设计sgRNA，考虑了靶向性、特异性和副作用等因素。

2.CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）：CRISPO使用最为广泛，是基于基因组的算法来设计sgRNA，考虑了靶向性、特异性和副作用等因素，并提供了对设计结果的详细分析。

3.CHOPCHOP（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）：CHOPCHOP提供了一个用户友好的界面，使用了基于基因组的算法来设计sgRNA，也会考虑靶向性、特异性和效率等因素。

4.CRISPRscan（https://www.crisprscan.org/）：使用了基于机器学习的算法来预测sgRNA的效率，并提供了对设计结果的可视化分析。

可以在筛选文库质粒中插入一个独特的引物结合位点